以上成果來(lái)自當(dāng)?shù)貢r(shí)間6月6日國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》(CELL)在線發(fā)表的重磅論文：《開發(fā)候選滅活疫苗BBIBP-CorV，對(duì)SARS-CoV-2能提供有效保護(hù)》(Development of an inactivated vaccine candidate, BBIBP-CorV, with potent protection against SARS-CoV-2)。

該論文通訊作者為中科院院士、中疾控主任高福、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所所長(zhǎng)秦川、中國(guó)疾控中心病毒病所應(yīng)急技術(shù)中心主任譚文杰、清華大學(xué)教授婁智勇、中國(guó)食品藥品檢定研究院李長(zhǎng)貴研究員、中國(guó)疾控中心生物安全首席專家、病毒病所黨委書記武桂珍等。

研究團(tuán)隊(duì)來(lái)自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所、國(guó)家人類疾病動(dòng)物模型資源中心、國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心、新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、清華大學(xué)等。

研究者詳述了SARS-CoV-2滅活候選疫苗(BBIBP-CorV)的實(shí)驗(yàn)性生產(chǎn)，該疫苗在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(食蟹猴猴子和恒河猴)體內(nèi)均能誘導(dǎo)高水平的中和抗體滴度，以提供對(duì)SARS-CoV-2的保護(hù)。在恒河猴的氣管內(nèi)免疫接種中，研究使用2μg/劑量的BBIBP-CorV便可提供了對(duì)SARS-CoV-2的高效保護(hù)，同時(shí)沒有檢測(cè)到抗體依賴性增強(qiáng)(ADE)感染。此外，BBIBP-CorV在疫苗生產(chǎn)中表現(xiàn)出高效的生產(chǎn)力和良好的遺傳穩(wěn)定性。

與SARS-CoV和MERS-CoV相比，SARS-CoV-2似乎傳播更快，導(dǎo)致對(duì)疫苗的迫切需求。迄今為止，三種候選疫苗(包括一種滅活疫苗、一種腺病毒載體疫苗和一種DNA疫苗)被報(bào)道以不同的效果保護(hù)恒河猴對(duì)抗SARS-CoV-2。滅活疫苗廣泛應(yīng)用于新發(fā)傳染病的預(yù)防，其研制速度較快，針對(duì)新冠病毒的預(yù)防具有較好的開發(fā)前景。值得注意的是，新出現(xiàn)的證據(jù)顯示，SARS-CoV感染的可能存在抗體依賴性增強(qiáng)(ADE)，提示研制冠狀病毒疫苗時(shí)應(yīng)特別重視安全性評(píng)價(jià)。

國(guó)內(nèi)的首個(gè)滅活新冠疫苗來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)中國(guó)生物。國(guó)藥集團(tuán)中國(guó)生物4月14日發(fā)布消息，公司旗下新型冠狀病毒滅活疫苗獲得臨床試驗(yàn)后，一期臨床已在河南焦作地區(qū)開展。

另一方面，由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所陳薇院士團(tuán)隊(duì)和中國(guó)康希諾(CanSino)公司聯(lián)合開發(fā)的腺病毒5型(Ad5)載體疫苗也取得了重大進(jìn)展。當(dāng)?shù)貢r(shí)間5月22日晚間，頂級(jí)醫(yī)學(xué)期刊《柳葉刀》(The Lancet)刊發(fā)一篇論文，題為“重組腺病毒5型載體COVID-19疫苗的安全性，耐受性和免疫原性：劑量遞增，開放標(biāo)簽，非隨機(jī)，首次人類試驗(yàn)”。陳薇等研究人員報(bào)告了在中國(guó)健康成年人中使用的Ad5載體COVID-19疫苗在接種后28天內(nèi)的1期臨床數(shù)據(jù)，初步評(píng)估疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。

疫苗設(shè)計(jì)和生產(chǎn)

研究團(tuán)隊(duì)從3名新冠住院患者的支氣管肺泡灌洗樣本及咽喉拭子中分離出3株SARS-CoV-2毒株，用于建立SARS-CoV-2滅活候選疫苗的臨床前體外中和攻毒動(dòng)物模型。3株新冠毒株分別是：19 ncov-cdc-tan-hb02 (HB02)， 19 ncov-cdc-tan-strain03 (CQ01)和19 ncov-cdc-tan-strain04 (QD01)。這3株毒株散布在系統(tǒng)發(fā)育樹的不同位置，表明其對(duì)SARS-CoV-2具有較好的代表性。

值得注意的是，所有這些毒株都是從Vero細(xì)胞中分離出來(lái)的，并已獲得世界衛(wèi)生組織的疫苗生產(chǎn)認(rèn)證。這些Vero細(xì)胞通過患者的咽喉拭子感染，而不是其他細(xì)胞系，以防止在病毒培養(yǎng)和分離過程中可能發(fā)生的突變。高效增殖和高遺傳穩(wěn)定性是研制滅活疫苗的關(guān)鍵。他們首先發(fā)現(xiàn)在三種病毒株中，HB02株的88個(gè)Vero細(xì)胞復(fù)制效果最佳，產(chǎn)生的病毒產(chǎn)量最高(圖1a)。因此，研究者選擇HB02株進(jìn)一步開發(fā)滅活SARS-CoV-2疫苗(BBIBP-CorV)。HB02株和其他從國(guó)內(nèi)和國(guó)際來(lái)源的SARS CoV-2毒株的全基因組序列的比較表明：HB02毒株與其他病毒株同源，并證明了主要保護(hù)性抗原(刺突蛋白質(zhì))有100%的同源性。這說明具有廣泛對(duì)抗各種SARS-CoV-2毒株的潛力(補(bǔ)充圖1和補(bǔ)充圖2)。為了獲得適于高產(chǎn)的病毒培養(yǎng)基，研究者對(duì)HB02株進(jìn)行了純化，并在Vero細(xì)胞中傳代產(chǎn)生了P1病毒培養(yǎng)基。將P1培養(yǎng)基在Vero細(xì)胞上進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)、傳代和擴(kuò)增。研究者將經(jīng)過7代適應(yīng)化的毒株(BJ-P-0207)作為生產(chǎn)疫苗的原種子(BJ-P1)。為評(píng)價(jià)遺傳穩(wěn)定性，研究者對(duì)其再傳代3次，得到P10病毒培養(yǎng)基。通過深度測(cè)序分析，我們對(duì)HB02株和P10株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，結(jié)果顯示它們的序列同源性大99.95%。此外，在P10原料病毒的全序列中，包括弗林分裂位點(diǎn)附近也沒有發(fā)現(xiàn)氨基酸變異，這些結(jié)果表明HB02毒株具有較高的遺傳穩(wěn)定性，有利于進(jìn)一步的發(fā)展。

為了高效制造，研究者建立了基于新型籃式反應(yīng)器載體的BBIBP-CorV的原料生產(chǎn)策略(圖1b)。對(duì)Vero細(xì)胞中P7培養(yǎng)基的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析顯示，培養(yǎng)基病毒能夠有效復(fù)制，在感染后48-72小時(shí)(hpi)達(dá)到最高滴度超過7.0 log10 CCID50，感染多重度(MOI)為0.01-0.3(圖1c)。為了滅活病毒產(chǎn)生，研究者在2-8℃，以1:40的比例將丙酸內(nèi)酯與收獲的病毒溶液充分混合。病毒的3批滅活消除了病毒的感染性，驗(yàn)證了滅活過程良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性(圖1d)。Western-blotting分析顯示，疫苗庫(kù)中含有病毒結(jié)構(gòu)蛋白(保護(hù)性抗原)(圖1e)。負(fù)染色的電子顯微鏡圖像顯示橢圓形病毒顆粒，直徑約為100 nm(圖1f)。

BBIBP-CorV的免疫原性

為評(píng)估BBIBP-CorV的免疫原性，研究者采用不同免疫方案和不同劑量(2、4、8μg/劑)疫苗注射BALB/c小鼠。

單劑量免疫組在第0天(D0)以三種劑量腹腔給藥，分別是高(8 μg/劑)、中(4μg/劑)、低劑量(2μg/劑)的BBIBP-CorV，觀察注射后7、14、21、28天中和抗體(NAb)水平。結(jié)果表明，高、中、低劑量組的血清轉(zhuǎn)化速率在免疫后7天都達(dá)到100%，同時(shí)免疫效果與時(shí)間相關(guān)(圖2,補(bǔ)充表1) 。低、中劑量組的中和抗體水平在7、14和21天顯示顯著的變化，但21天到28天之間無(wú)顯著差異。在高劑量組中，僅在7 、14天觀察到顯著變化(圖2a)。

雙劑免疫組采用不同免疫方案(第0天/第7天、第0天/第14天、第0天/第21天分別進(jìn)行免疫)。雙劑量免疫中的高、中、低劑量組在第二次免疫后7天的血清陽(yáng)性達(dá)到100%(圖2 b,補(bǔ)充表1)。高、中劑量的雙劑免疫方案的免疫原性明顯高于單劑量免疫方案。采用第0天/第21天方案的第二次免疫后7天，其中和抗體水平最高。

研究者還測(cè)試了三劑免疫程序的免疫原性。他們?cè)?天、7天和時(shí)14 天在小鼠腹腔接種三種劑量的疫苗，分別是高(8μg /劑)、中(4μg /劑)或低(2μg /劑)疫苗 (圖2c)。在第7、14、21、28天測(cè)定各組的中和抗體水平，在第一次免疫后第7天，三組血清轉(zhuǎn)化率均達(dá)到100%(圖2c，補(bǔ)充表1)。

結(jié)果顯示，三劑 (0天/7天/14天)免疫接種方案在第28天時(shí)的中和抗體水平，均高一劑免疫接種方案(圖2a和2c)。此外，他們分析了單劑、雙劑(0天/21天)和3劑(0天/7天/ 14天)免疫接種小鼠采用高、中、低劑量疫苗的中和抗體水平，并在第一次免疫后的28天檢測(cè)中和抗體水平，以保持相同的起止點(diǎn)。結(jié)果顯示，三劑量(0天/7天/14天)免疫接種方案的免疫原性高于單劑量和雙劑量免疫接種方案(圖2d)。

接下來(lái)他們?cè)谕米印㈦嗍蟆⒋笫蠛托∈蟮炔煌膭?dòng)物模型中測(cè)量BBIBP-CorV的免疫原性。采用單劑量(D0)免疫接種方案對(duì)動(dòng)物進(jìn)行高劑量(8μg/劑)、中劑量(4μg/劑))和低劑量(2μg/劑))疫苗免疫，免疫后21天測(cè)定中和抗體水平。結(jié)果表明BBIBP-CorV具有良好的免疫原性，免疫后21天在所有動(dòng)物模型中血清轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，(圖2 e,補(bǔ)充表1)。在三劑(0天 / 7天 / 14天)免疫組，食蟹猴、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠接種高(8μg /劑量)中(4μg /劑量)或低(2μg /劑量)劑量的疫苗。免疫后21天在所有動(dòng)物模型中血清轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。第一次免疫后21天的中和抗體水平表明，在兔和豚鼠模型中三劑(0天/7天/14天)免疫程序的高、中、低劑量下，均高于單劑(0天)免疫程序 (圖2 e 2 f,補(bǔ)充表1)。

非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中的保護(hù)作用

研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了BBIBP-CorV對(duì)恒河猴的免疫原性和保護(hù)作用。

所有的恒河猴在第0天(D0)和第14天(D14)免疫2次。安慰劑組肌肉注射生理鹽水，兩組實(shí)驗(yàn)組肌肉注射低劑量(2μg/劑)或高劑量(8μg/劑)BBIBP-CorV(圖3a)。病毒攻毒前，低劑量組和高劑量組的NAb GMT分別達(dá)到215和256(圖3b)。在D24(第二次免疫后第10天)，所有恒河猴在麻醉下經(jīng)氣管注射l06 TCID50的SARS-CoV-2。病毒感染后0 至7天，接種組和安慰劑組的體溫在范圍內(nèi)波動(dòng)(圖3c，補(bǔ)充圖4a)。

另外，恒河猴在攻毒后血清生化參數(shù)保持不變(補(bǔ)充圖3)，這一結(jié)果表明，接種BBIBP-CorV不會(huì)在血清生化參數(shù)方面顯示出副作用。

接下來(lái)研究團(tuán)隊(duì)用RT-PCR測(cè)定了恒河猴咽喉和肛門拭子的病毒載量。結(jié)果顯示，所有安慰劑組恒河猴在攻毒后整個(gè)評(píng)估期間均顯示并維持高病毒載量(圖3d、3e，補(bǔ)充圖4b和4c)。

低劑量組恒河猴咽喉拭子病毒載量則在5dpi時(shí)達(dá)到峰值(5.33 log10拷貝/毫升)，7 dpi時(shí)下降至1.12 log10拷貝/毫升，明顯低于安慰劑組。值得注意的是，低劑量組的4只恒河猴中有3只在7 dpi時(shí)已無(wú)法檢測(cè)病毒載量。而高劑量組4只恒河猴咽喉拭子病毒載量均為陰性。另外，高劑量組4只恒河猴中的2只肛門拭子也未檢測(cè)到病毒載量。

7 dpi時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)所有動(dòng)物實(shí)施了安樂死，以確定肺組織中的病毒載量并進(jìn)行病理檢查(圖3f、3g)。在低劑量和高劑量組中，所有恒河猴在任何肺葉中均未檢測(cè)到病毒載量，這與安慰劑組的結(jié)果有顯著差異(圖3f)。安慰劑組在左肺、右肺和右副肺檢測(cè)到高病毒載量，病理組織學(xué)分析為嚴(yán)重間質(zhì)性肺炎。

然而值得注意的是，在安慰劑組的7個(gè)肺葉切片中，只有3個(gè)被檢測(cè)出有感染。論文指出，這可能是因?yàn)椴《驹诜稳~中的感染是動(dòng)態(tài)變化的。

總的來(lái)說，接種BBIBP-CorV疫苗后，所有恒河猴的肺均正常，少數(shù)肺葉有局部輕度組織病理學(xué)改變(圖3g)，這說明接種BBIBP-CorV疫苗可有效阻斷猴子SARS-CoV-2感染。

7dpi時(shí)，接受安慰劑治療的恒河猴產(chǎn)生低水平的NAb，滴度為1:16，而高劑量組NAb水平最高可達(dá)1:2048(平均1:860)，低劑量組NAb水平最高達(dá)1:1024(平均1:512)(圖3b)。研究指出，這些結(jié)果表明，低劑量和高劑量的BBIBP-CorV對(duì)恒河猴SARS-CoV-2具有高效的保護(hù)作用，且沒有觀察到抗體依賴性增強(qiáng)感染。

安全性

研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)大鼠(Sprague-Dawley)進(jìn)行了單次肌肉注射實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估BBIBP-CorV的急性毒性。研究將20只大鼠分為2組(n=10, 5/性別)，肌肉注射3倍劑量BBIBP-CorV (8μg/劑，24μg/大鼠)，生理鹽水作為對(duì)照組。接種后連續(xù)觀察14天，第15天實(shí)施安樂死，評(píng)估系統(tǒng)解剖和觀察。

四組大鼠接種后連續(xù)14天內(nèi)未見死亡或即將死亡，也未見明顯臨床癥狀。此外，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在體重和喂養(yǎng)狀態(tài)上均無(wú)顯著差異(圖4a，補(bǔ)充圖4d)。安樂死后這些大鼠無(wú)組織病理學(xué)改變。

值得注意的是，大鼠單次肌肉注射的最大耐受劑量(MTD)為24μg/大鼠，相當(dāng)于人體的900倍。研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，這表明BBIBP-CorV對(duì)人體有潛在的良好安全性。

研究團(tuán)隊(duì)隨后通過豚鼠肌肉注射和靜脈注射評(píng)估BBIBP-CorV引起的全身過敏反應(yīng)。通過臨床觀察和測(cè)量豚鼠體重，結(jié)果顯示敏化期間未見異常反應(yīng)(圖4b)。陰性對(duì)照組(生理鹽水)和實(shí)驗(yàn)組在D19、D26均未發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)癥狀。陽(yáng)性對(duì)照組(人血白蛋白)過敏反應(yīng)高度陽(yáng)性(1/6只動(dòng)物為陽(yáng)性，3/6只動(dòng)物為強(qiáng)陽(yáng)性，2/6只動(dòng)物為極強(qiáng)陽(yáng)性)。與之形成鮮明對(duì)比的是，低、高劑量試驗(yàn)組D19、D26均無(wú)過敏反應(yīng)，且過敏反應(yīng)均為陰性。

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步評(píng)價(jià)了BBIBP-CorV對(duì)恒河猴的長(zhǎng)期毒性。40只獼猴(20/性別)被分成4組(5/性別/組)，分別肌內(nèi)注射生理鹽水(組1)或2μg、4μg、8μg BBIBP-CorV(組2-4)。每組分別有3只在D25解剖，其余2只在D36解剖，進(jìn)行系統(tǒng)解剖和組織病理檢查。

在試驗(yàn)期間，組2-4沒有出現(xiàn)死亡或即將死亡，淋巴細(xì)胞亞群分布(CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD20+,CD3+CD4+/CD3+CD8+)、細(xì)胞因子(TNF-αIFN-γ,IL-2，IL-4，IL-5和IL-6)、c反應(yīng)蛋白、或體重觀察也沒有重大異常臨床生理和病理指標(biāo) (圖4c-4e,補(bǔ)充圖4e)。

D25和D36時(shí)各劑量組的安樂死獼猴系統(tǒng)解剖未見異常。D25時(shí)組2-4均出現(xiàn)了肉芽腫性炎癥，并在恢復(fù)期(D36)結(jié)束時(shí)依然存在，但與D25相比略有改善。獼猴只表現(xiàn)出局部刺激，表現(xiàn)為輕度到重度肉芽腫性炎癥，但在注射后兩周沒有這種反應(yīng)。8μg/劑實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出未觀察到的不良反應(yīng)水平(NOAEL)。